清華大學頭前溪底泥檢測與生物毒性研究設計與結果1

 我們學校的自然探究實作有個超級龐大的重頭戲－新竹水質與人權議題中的自然探究實作。

不過，基本上，我們科只有一位老師是做環境（土壤）化學檢測的，其他老師都不是這個專業。

更不用說，十多位老師中，大概只有我是長期關注新竹的水資源議題，大多其他老師們連聽都沒有過。

對於本校的其他自然探究實作授課老師們來說，教這個主題真的需要是拼了命地跟上。

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所以，為著讓自然探究實作授課教師們更能掌握的核心知能，讓教學愈來愈游刃有餘，我在上學期辦了兩個講座增能：

1. 邀請乾淨水聯盟王志文打頭陣，引導老師們連結探究實作與新竹SDGs環境議題（講座錄影、投影片）。
2. 另外就是透過志文邀請清華大學周秀專教授（環境預防醫學實驗室）。 老師來分享「新竹流域的污染鑑識－客雅溪」的研究成果。（講座錄影）

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秀專老師來，分享的主題是利用底泥檢測河川的重金屬，而且是利用細胞毒性作為對人體健康影響的指標。

目前全世界的政府部門如果要判斷河川水污染的健康影響，多半是驗河水，而且是直接用各種法規的規範值來做標準。

不過，以河水當作樣本，很容易受到雨量、逕流量的影響，而且多半只能看取水當下的狀況，抓不到那種偶爾偷排的，也完全無法看長期累積的影響。

用底泥則可以看到累積一段時間的影響，比較不會受偶發因子的干擾。

而用對細胞的毒性當指標當然比法規常使用的物質濃度更能直觀地連結到對人體的影響。

（另一個大重點是，可以看底泥中所有物質的綜合影響，不用擔心「因為不知道要驗什麼物質而無法看影響」）

這次只有客雅溪的結果，沒有頭前溪的。

以下是關於研究的筆記，

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一開始做簡單的背景介紹。

老師的研究重點是環境污染物（空氣、水與土壤 ）的生物效應，今天分享的焦點當然就是水的部分。

「活」這個字是千+口+水，意思是要多喝水才活得下來。

雖然地球表面的淡水只有萬分之三，但台灣比較主要的問題是水污染。

台灣的中央河川中有中重度污染的高達25%。

政府也很關心，在全台灣設定很多監測站。

但這些測站所產出的水質指標是RPI (River Pollution Index)。

RPI主要觀測水中溶氧、生化需氧量（有機污染程度）、懸浮固體、氨氮（水中動植物排泄物、屍體分解的影響），所以反映的是「有機物」的影響，而無法反映重金屬與環境荷爾蒙的影響。

以RPI來看，九大嚴重污染測站主要是在台南（佔四個），RPI值最高的也是在台南。

新竹的RPI指數非常好，所以常被政府單位的新聞稿描述為水質優良～

但新竹沒問題嗎？

因為，科技日新月異，使用的物質形形色色。

各種製程中使用的新興污染物被列管的比例其實非常、非常低。

測水樣無法反映真實情形（沖刷、濃度低、無累積效應）。

加上環境當中有太多沒有列管（檢測）以及未知的，每一年都有很多新增的。
一個一個檢測都緩不濟急，乾脆用人的細胞株。

好處是在很多病理實驗都已經使用人的細胞株，所以會有很多有意義的資料可以參照。

驗證什麼呢？

首先，這是一個污染物的檢測平台，所以必須要能反映污染物真正的樣態。

所以量化的方向與工具是「細胞毒性」

細胞如何死亡（細胞凋亡或壞死）都已經有很好的指標可以作為偵測項目。
而這些指標都已經有容易的技術可以測得。

第一個技術是ＭＴＴ

利用粒線體中的一種去氫酶會把MTT這個化合物變成紫色。
當紫色越明顯，就表示這個細胞的存活度越高。

另外，把底泥萃取物以DMSO稀釋成1%的濃度，加入11種細胞株（對照組為沒有底泥萃取物的純DMSO溶液）

結果顯示下游的細胞存活率很低，只處理了２４小時，竟然讓細胞死了一半。

每一種細胞株都是!
中游的萃取物雖然沒有下游萃取物那麼具有傷害性，但其實也明顯比上游嚴重。

這代表「從上游到下游的萃取物對細胞的傷害的確是有累積性的」。

這是第一次有資料可以支持我們的想像。

更令人驚訝的是這樣的細胞死亡率表示底泥萃取物對細胞的傷害比之前實驗室做的癌症用藥還要大。

這造成這樣高死亡率的底泥萃取物是從多少底泥萃取出來的呢？
換算回去的話，只要10mg的底泥就可以造成這樣的傷害！
（平常吃的普拿疼是250mg）

（不過這並不能直接套在人體攝取或接觸的上限值喔！）
人是一個個體，有很多系統可互相補償，但久了會有問題

第二個指標是細胞附著形態

正常的動物細胞都會附著在培養基上，但若是受傷的細胞，就會浮起來很快就死掉（癌細胞轉移的概念）
在結果中可以看到中游與下游的萃取物都會使細胞明顯容易浮起來。

第三個指標是細胞移動
製造一個傷口，正常來說細胞會往中間移動，將傷口癒合。
然後比對48小時後，傷口癒合的狀況。
結果發現下游的萃取物會讓傷口修復的面積明顯低於控制組。

第四個指標是Reactive oxygen species level。

癌症的一開始其實是發炎反應，因為有很多的過氧化物ROS。
所以可以藉由ROS的程度來推估。
實驗室用了DCFH-DA當作呈色劑，如果有ROS就會呈現螢光綠色。
下游的萃取物的螢光很明顯的高於上游、中游與控制組。
發表在https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651321011775?ref=pdf_download&fr=RR-2&rr=8dc094ebeaf74a88

哪些細胞或是器官是對這些萃取物比較敏感的呢？

老師用了第五個能夠看細胞凋亡的技術「JC-10」 （肝臟細胞株）

在這個技術中，如果是健康細胞的粒線體就會看起來是網狀的，但如果是正在凋亡當中的，就會是點狀的。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651323000635
在健康的細胞中，JC-10出現的位置（紅色螢光），會是在內膜。
但在不健康的細胞中，JC-10 會被釋放到細胞質中，會變成綠色，而且變成點狀。

所以我們可以看紅色與綠色的比例，可以判斷死得怎麼樣。

在圖的左側是綠色，右側是紅色。

正常狀況下，大約會有10-20%（因為氧氣攻擊所以）是綠色，會有70-80%是紅色（健康）的;。

在對照組，左邊綠色的很少、右邊紅色的很多
下游的萃取物在左側、綠色的部分很明顯的高很多。

第六個量化方式－看細胞膜外翻。

因為細胞膜的外翻是細胞死亡的第一步。
但這個方法沒有JC-10好用（還是，沒有辦法說出老師想說的故事？應該要再問一下老師。）

因為這個研究是在做肝臟細胞，所以可以利用肝臟細胞釋放出來的GOT/GPT比值來評估。
釋放比較多，就表示細胞破壞比較嚴重

就結果看，下游底泥萃取物對肝臟細胞的破壞很嚴重。

第七個量化方式－肝臟合成肝醣（醣質新生）的效率？

在糖質新生的效率上，下游底泥萃取物所處理的肝臟細胞株顯著的較差。

老師的實驗室也研究了相關的酵素活化機轉，支持了污染物造成釋放多的dk3
能分子機轉。

(the phosphorylation (active stae) of IRS-1and AKT significantly decreased under exposure to downstream extract; however, there was no differenceinthe total levels of IRS-1 and AKT.)

後來繼續有很多的研究發表。

*The protein level of GSK3B phosphorylation decreased, whereas the total levels of GSK3B increased in liver cells treated with DSE.
*GYS phosphorylation increased in liver cells treated with DSE.

Cell viability after seiment extract treatment

我們發現有一種細胞在1%的處理下就有大規模死亡了，就是生殖腺的細胞。
我們換用0.5%的萃取物，結果發現不論在24或是48小時的處理（７重複＋３independent test）後，結果發現生殖細胞的存活率都顯著低於非生殖細胞。

如果合併這個資料（Fragile fertility/ Taiwan's plummeting birth rate）

前兩年有個研究揭露這半個世紀以來男性精子數下降了一半。
很多人認為跟環境物染物有關。所以不是不婚不生，是因為環境污染物。

台灣的生育率非常低，老師們在招生上，一定也已經非常有感。
少子化不見得是選擇，而是受環境決定。

那，是不是真的不同的生殖系統的細胞株也是有一樣的狀況呢？

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Immunofluorescence_A2780
在女性的生殖細胞株中，發現 在Mitotracker應該在融合後要有網狀、有overlapping的結構，結果發現下游的萃取物會讓它全部變成點狀，也就是細胞都受損了！！！

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Cell viability after seiment extract treatment

如果分成不同系統去看底泥萃取物的細胞毒性，會發現生殖系統的‘生存率真的比較低
而且我們也發現腎臟細胞株的存活率也比較低！！！

第一是，最新研究顯示七成以上的癌症風險來自於外因（我倒覺得不能忽視「人活太久」這個因素）

如果加上93-102年惡性腫瘤死亡率最高的鄉鎮這樣的資料，都是靠海的。

2015，新竹香山這個靠海的區域，竟然擠上惡性腫瘤死亡站死因比例的前十名。

（不知道後幾年的變化如何，如果搭配上客雅溪下游禁止耕種後的變化，可以有哪些詮釋？）

幾乎所有在這張投影片上的所有鄉鎮市區都是靠海的。

中研院地圖資訊中心整理1979年－2017年的癌症好發率的資料

如果Hopkin淋巴瘤來看，2020年台閩地區的２２縣市當中，新竹縣與新竹市包辦了前四名的一半。

淋巴系統是做什麼的呢？
淋巴系統與免疫力有關，當免疫力被壓制的時候，就會對身體很不好

以前都會說以前的淋巴癌發生在有錢人家的孩子，因為有錢人家的孩子都會被保護得很好，不太有機會在赤腳赤手地上爬，也就是不太有機會訓練小孩的免疫系統。

但我們現在不是。
我們現在是已經太過分地訓練免疫系統，已經到了壓制免疫系統的程度。
就像是愛滋病。
外來的物質已經直接攻擊免疫系統。

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如果就男性生殖系統的癌症來看，全台灣攝護腺癌比例最高的是新竹市。
女性的子宮體癌，新竹縣市分居第一跟第二。

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最近有個很大的新聞，大阪遭PFAS污染，煮沸也不能去掉。
會傷害內分泌、肝腎、生殖器官。
暴露在這個環境下，會傷害甲狀腺癌。
就可以連結到新竹縣市甲狀腺癌分居第一與第三。

這些新興污染物會有很多的影響。

這就可以連結到台灣的洗腎率。

11301頭前溪流域學校07-竹東水路走讀

這一天，請到竹東鎮民代表葉日嘉先生來帶學生走竹東的水路。

第一站是學校旁邊的涼水井。

竹東高中在竹東最高的河階，緊鄰著山壁。

這些山壁會有很多滲水，所以這一帶的居民對這些水有很充分的利用。

包含這個涼水井，據說目前都還有人取水回去飲用（有煮沸）

學校門口的小巷子以前是粄條巷。

也是因為這邊有很多（當時相對）乾淨的水源。

斜對面就是日治時期的輕便車站，因為學校前面就是可以直通新竹車站的輕便車道喔。

學生很驚訝呢！

沿著學校前面的東寧路，路邊的住家也都有建造小小的取水口。

只要把出水口堵住，就可以讓圓圓不覺得山壁滲水累積起來，洗一些東西很好用。

走到曉江亭時，日嘉代表跟我們說了這個地點在以前的水路、開發時的意義。

從暁江亭旁邊下去就是一個洗衫坑。

我特製了十五條髒毛巾給學生洗。

有咖啡、醬油、咖哩的污漬。

不過學生顯然不會用手洗衣物。

他們都是拼命把肥皂抹上去，然後在水裡浸啊浸的。

沒有想到要用手搓，也沒有發現自己站在石頭洗衣板上。

所以本來只有一小塊的污漬，變成整個毛巾都是髒的了哈哈哈。

學生看到旁邊真的有居民在洗衣服，整個宇宙觀炸掉。

（因為他們以為介紹的是古早人在這邊洗衣服）

接著我們穿過小巷，切到中興河道上半段。

這個地方的中興河道已經有味道了。

不過旁邊的洗衫池並不是用河道中的水，而是山壁滲水。

接著走到中段。

學生很驚訝竹東有很大的全聯哈哈。

 

113探究實作A第九週-提問訓練(刪除優格蛋單元的班級)

這個班沒有做太陽優格蛋的單元。

是直接用在蠟燭燃燒單元中，看別組海報成果時，記錄下來的問題做收斂。

如果跟用太陽優格蛋做提問訓練相比，理組班用蠟燭燃燒當提問訓練反而是不好的選擇。

因為他們有2/3的原理都是在問原理或技術，甚至有很多都是在討論無法觀察的對象。

例如氣體分子間距、氧氣是否耗盡......等等。

（當然這些問句都很精彩，各自對應到一個研究者不同的思考階段，我有讓學生知道自己的問句對大家是非常有幫助的）

在收斂提問（提出一個可以做實驗檢驗的問句）該有的特徵後，就直接進到口罩階段。

等待補上照片

 

基本上只進到讓學生熟悉機器，思考自己的提問。

但可以從寫在黑板上的句子等待補充照片看出來，前面收斂的「要有操縱與應變變因」在這邊幾乎看不到。

所以跟他們解釋提問的走向。

請他們小組要在下週帶來修正過的題目。