發酵工程初探--應用生物學探究與實作

從朋友那邊得到三種發酵食品，容易操作（不用無菌操作、可以室溫培養），也很容易得到學生歡心（超級好喝/吃），還能找到很多好資料。
我用其中一種發展了一組課程，但我相信其他兩種也可以照樣操作。
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食品簡介
這三組發酵食品是milk kefir、water kefir及kombucha。

milk kefir牛奶克菲爾是用牛奶（無糖豆漿也可以）為原料，產物呢，簡單來說是優酪乳，但是跟市售優酪乳很不一樣。
首先，市售優酪乳菌種簡單（通常在八種以內）而固定，牛奶克菲爾中的菌種複雜（可以超過30種）而變動大。因為還含有真菌，這些真菌會製造多糖，形成膠膜狀構造，不止會形成像粉圓一樣的小球體，還會讓優酪乳濃稠，不用加增稠劑就可以。因為菌種複雜，代謝出來的有機酸跟芳香烴類就很多樣，所以牛奶克菲爾的風味比市售優酪乳要多很多。

water kefir(aka tibicos )糖水克菲爾。原料是蔗糖，產物主要是乳酸，酒精及二氧化碳，後期會有的甜味是來自甘露醇。成品是酸甜的微酒精氣泡飲料，網路上有非常多教學影片，配方做法都不一樣。

在美國很多人用椰子水去做，然後每天換。我還沒試過這個做法。據網路上的影片來看，用椰子水去做可以有非常大的產氣量。我猜是椰子水裡有大量的游離胚乳核，大量的核苷酸可以作為刺激真菌分裂的細胞分裂素，所以產氣量大。但是因為台灣弄椰子水比較貴，我還沒試過。

我是用蔗糖水，3~5天換一次，視氣溫而定。喜歡氣泡多的話，加顆（沒有防腐劑、沒有燻硫）無花果可以增加酒精發酵的菌種代謝。
有人說不能加黑糖，可是也有人說加黑糖很好。我試過加黑糖及紅糖，好像沒什麼不可以，但因為酒精味比較重，我不愛，所以後來就還是用蔗糖。
網路上還有很多人說要加小蘇打（還是蘇打？）調整酸鹼值，但我認為那只是改變菌種生長的順序與速度。而且發酵過程產生的酸（還有他們很愛加檸檬片），可能也會和小蘇打進行化學反應，產生二氧化碳。那種配方看到的氣泡量很大的原因可能是這個。
（如果有夥伴願意嘗試找到原因那就太好啦）

kombucha紅茶菌，含糖紅茶為原料，產物主要是醋酸，酒精及二氧化碳。可以簡單快速做出各種醋。因為有會產生細菌纖維素（？）的菌種，所以會產生一層果凍狀的厚膜，變化更多一些，可以拿來做甜點、軟糖、椰果與衣服（！）

以上三種都是需要氧氣，所以用布或餐巾紙封口就好，不要密閉。

下面是除了罐子之外需要的器具

因為據說不能碰到金屬，所以我準備了一個玻璃壺煮水。
但是我自己覺得啦，其實只要容器是玻璃的就好，其他的器具接觸菌的時間不長，應該是不太會有影響。不過因為東西都買了，所以我也沒有特別嘗試用金屬的東西去操作。

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基本概念

1.操作

這三組發酵食品雖然不需要無菌操作，但基本的清潔與培養概念還是要教學生。

另外，之所以不需要無菌操作，是因為利用優勢菌種可以淘汰弱勢菌種的概念。所以，維持我們要的菌種在優勢狀態很重要，也就是要給這些菌充足的營養。更換培養基（牛奶、糖水或紅茶）的時間間隔、環境溫度與氧氣濃度就決定了裡面優勢菌種的組成。

以牛奶克菲爾來說，12小時換一次跟24小時換一次，裡面的優勢菌種就會不一樣。我是建議不要超過一天，拖太久，利用乳糖的菌種沒原料，就會讓雜菌有機會生長。

Milk kefir裡的細菌可以在較低溫度生長，而真菌需要較高溫。所以夏天的牛奶克菲爾會比較多真菌做的多糖，顯得濃稠，冬天時做出來的就比較不稠。

網路上的資料都說不要用金屬的濾網與湯匙，我猜可能跟金屬會影響微生物的代謝反應。
我沒勇氣嘗試，也許有興趣的夥伴可以做些實驗試試看。

如果發酵速度太快，不建議用放冰箱來減緩速度。因為當優勢菌種生長速度減緩，雜菌就容易長出來。
可以用減少菌量或是減少原料（或兩者一起）來控制產物量。

如果要比較長時間無法更換培養基，以牛奶克菲爾來說，還是可以放冷凍。
解凍後，縮短更換牛奶的時間，讓優勢菌種早點取回優勢，應該就可以。在解凍後的第一次培養，建議還是先將器具消毒一下，因為優勢菌還不太優勢啊。

無糖豆漿也可以拿來做為原料，我的學生做完後，有的人很喜歡，有的人覺得很恐怖。
我覺得如果要嘗試，建議多更換幾次豆漿，等菌種穩定後，在開始把成品拿來吃。一開始菌種的消長還沒穩定，可能有些蛋白質分解的中間產物還沒有足夠的菌可以繼續分解，可能會有些不好的口味與氣味。

2.菌種與安全

也因為太多因素會影響微生物的生長，這些食品中的菌相變動很大，在食品安全上常讓大家有疑慮。但是，在操作得當、適量攝取的狀況下，可以說幾乎沒有健康風險。

因為益生菌對健康的影響中，其中有一個是跟菌種本身不太有關係，而是菌相的複雜度。多樣的菌相可以提升腸道淋巴組織的狀態，讓我們的免疫系統有真正（但又不會有實質傷害的）的敵人可以對抗，就不會閒閒沒事做去攻擊我們自身的細胞，這是益生菌能降低過敏反應的其中一個機制。
（所以常用抗菌產品的人，反而容易有過敏的產生）

3.二次發酵

每次更換培養基（牛奶、糖水或紅茶）時，是將像粉圓（或像果凍）的固體留在罐子裡，把液體倒出來。

罐子裡加入新的培養基（牛奶、糖水或紅茶），開始新的一輪發酵。

每組發酵食品裡的菌種都有自己的生長順序，所以更換的時間會決定哪一類菌長得最好。

倒出來的液體也含有很多菌，所以可以再加入新的培養基做二次發酵，這時候就是可以玩不同變化的時機了。

舉例來說，牛奶克菲爾在一次發酵8小時候，將液態部分倒在另一個罐子中，這一罐若能盡量倒滿後密封12小時，成品會酸度適中、質地柔滑。因為在8小時的時候，產氣的真菌還沒有開始快速增長，而主要作用的乳酸菌是好氧的乳酸菌。當我們提供缺氧環境時，則換另一批乳酸菌開始長。

還可以將做麵包的酵母減少到30%，然後加入70%的牛奶克菲爾，發酵時間拉長到六小時（記得加保鮮膜）。
烤出來的面包會很細緻柔軟（因為產氣速度比較慢，量比較少，然後又有分解蛋白質的菌種在裡面，所以筋性會降低）

液態的部分還可以放冷凍庫，就變成優格冰沙（記得加糖啊）
固態部分長太快可以把它們吃掉一些，有人也把固態部分用紗布包起來，加壓把水擠出來，就變成很像乳酪的東西。

糖水克菲爾則可以加入各式果汁，做天然的碳酸果汁飲料。因為一開始我們的糖水濃度高，所以倒出來的菌液濃度也高，直接加果汁做二次發酵對我來說有點味道太重（但非常好喝），所以我目前比較喜愛的比例是菌液：果汁：水=1：1：1。我喜歡蘋果汁（比蘋果西打還好喝）、橘子汁（比芬達好喝多惹），目前在嘗試蔓越莓、水蜜桃、杏桃跟酪梨。椰子汁則是會有比較重的酒精。
糖水克菲爾的二次發酵產氣量大，所以在氣密瓶中作要小心瓶子本身有瑕疵。
不喜歡氣泡感的話，只要放在一般瓶子就好，還是要加蓋喔，二氧化碳會從縫隙漏掉。

紅茶菌分離出來的菌液很酸，建議不要空腹直接喝。稀釋一點或加果汁調味會比較不傷胃。
我現在喜歡也加入果汁去做二次發酵。舉凡可以作為果醋的，應該都是很好的搭配。也有人加綠茶。

二次發酵要多久？就看大家喜好，反正果汁作為原料，時間越短，被分解的程度就越少。果香會比較接近原來的味道，多些乳酸，跟一些二氧化碳造成的氣泡口感。時間長一點（以目前夏天大概30度左右的氣溫）放36~48小時的話，原來的果汁味道會比較不明顯，除了更多
乳酸味道之外，二氧化碳與酒精就會很明顯。如果放在可以氣密的瓶子，開瓶時就會很刺激喔，會噴的比香檳開瓶還高。

三組菌裡的菌種都有共通性，所以只要用不同培養基，就可以慢慢轉變成另一組菌。
比如說糖水克菲爾只要用牛奶慢慢養，可以轉成牛奶克菲爾的～因為都有乳酸菌啊！

然後因為兩種克菲爾裡都有啤酒酵母，所以只要慢慢加澱粉下去養，提高啤酒酵母比例，就可以當作發麵團的液態酵母喔～

如果學生要做氣密，請務必提醒注意～如果玻璃瓶有敲過，雖然沒有裂痕，但是氣壓高的時候會爆掉的。安全上是還好啦，我比較討厭清理（我爆過四瓶）。所以建議放在一個可以關起來的小箱子或是袋子裡，這樣爆掉的話，也很好清理。

作固液分離時，可以用一個塑膠濾網（網子本身也要是塑膠的喔）跟漏斗幫忙

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課程設計
以下是我的設計，有很多其他的玩法，看教學目標而定，也可以跟化學科合作喔～
可以針對發酵過程探討，也可以針對發酵產物，如果學校有做fingerprinting的設備，也可以做菌種鑑定。再來就是不同配方及更換時間，會對菌相或是產物有什麼影響？真的不能用金屬的嗎？用了有什麼影響？還有太多變因可以測試，應該可以玩得很大。而且學生自己都會有很多疑問的。

我原本的設定是希望學生能瞭解發酵就是化學反應，然後可以找出影響這組化學反應的因子有原料、菌種、環境因子如溫度、酸鹼度等。
後來到一半時，發現學生連「問出一個可以用實驗檢測的問題」都不會，所以就目標就改為這個，然後能設計出正確的「實驗組、對照組」就好。（這個雖然考試都會選對，但是叫他們自己設計就幾乎全部破功）

我是用water kefir做主軸，因為這個受歡迎程度比較高。

如果要用紅茶菌kombucha作為主軸，資料更多。
這組菌裡，有木質醋酸菌，所以可以合成(應該是)細菌纖維素，用椰子汁養，就會出現真正的椰果喔。

這三組菌的簡單比較如下，產物及菌種都只是大概而已喔。

	牛奶克菲爾milk kefir		糖水克菲爾water kefir	紅茶菌kombucha
原料	全脂牛奶		20%蔗糖溶液	12%蔗糖紅茶
產物	主要是乳酸、少量二氧化碳、各種小分子有機酸		乳酸、CO2、甘油、醋酸及甘露醇	主要是醋酸、乳酸、少量二氧化碳
細菌	Acetobacter fabarum Acetobacter lovaniensis   Acetobacter syzygii   Acinetobacter   Bifidobacterium spp Dysgonomonas   Enterococcus faecium   Gluconobacter japonicus Halococcus spp. Lachancea meyersii Lactococcus lactis subsp. cremoris   Lactococcus lactis subsp. lactis   Leuconostoc lactis Leuconostoc mesenteroides   Pelomonas   Pseudomonas putida     Shewanella   Streptococcus thermophilus Weissella	乳酸菌 Lb. amylovorus   乳酸菌 Lb. brevis   乳酸菌 Lb. buchneri  乳酸菌 Lb. casei   乳酸菌 Lb. paracasei   乳酸菌 Lb. crispatus  乳酸菌 Lb. delbrueckii 乳酸菌 Lb. helveticus   乳酸菌 Lb. kefiranofaciens   乳酸菌 Lb. kefiri   乳酸菌 Lb. parabuchneri 乳酸菌 Lb. parakefiri   乳酸菌 Lb. plantarum 乳酸菌 Lb. satsumensis 乳酸菌 Lb. uvarum	乳酸菌 Lb. hordei/mali  乳酸菌Lb. harbinensis/brevis  乳酸菌Lb. casei/rhamnosus/paracasei  乳酸菌 Lb. hilgardii/diolivorans  乳酸菌 Lb. ghanensis/nagelii  雙歧桿菌Bifidobacterium psychraerophilum:  醋酸菌 Acetobacteraceae                   未知菌種	Gluconobacter oxydans Komagataeibacter sp. K. intermedius, K. kombuchae
真菌	Candida inconspicua Geotrichum candidum   Kazachstania aerobia Kazachstania exigua Kazachstania unispora   Kluyveromyces lactis   Kluyveromyces marxianus   Kluyveromyces marxianus var. lactis	Pichia fermentans   Pichia guilliermondii Pichia kudriavzevii Saccharomyces cerevisiae   Saccharomyces martiniae   Saccharomyces turicensis   Saccharomyces unisporus	釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 酒香酵母Dekkera bruxellensis	Pichia, Brettanomyces/Dek-kera, Candida Zygosaccharomyces; Zygosaccharomyces bailii

分成三個階段
一、引誘+觀察                                                                                                                                       
我得到這三組菌之後，因為量不夠三個班的學生分，所以我花了些時間先把菌養夠，才開始這個課程。在這個過程當中，也讓我自己熟悉菌的狀況跟可能出現的問題。

這三組菌都是好喝的菌，變化也很多，有很多玩法，如果喜歡，老師自己可以玩出很專業的東西喔。
以milk kefir跟kombucha來說，都有商業生產的產品，而且還很高貴~

我在上學期倒數第三週，把三組菌的二次發酵產品帶給他們喝，大家都很喜歡，尤其是糖水克菲爾的蘋果汁二次發酵。大家自己選要哪一種都可以，登記給我（當然學生有自己喜歡的發酵食物想嘗試也可以，像是我還有提供紅麴跟酒麴，另外給他們操作說明。）

倒數第二週則是請他們自備玻璃瓶（不用太大，因為菌也不多，但不能是金屬蓋子），我帶菌種去分給他們。

最後一周跟學生聊聊，確認他們養菌的方法沒有太天兵（有人整罐拿去蒸，我也不懂為什麼），就交待寒假作業，請他們紀錄養菌的過程中，想到的疑惑，還有查了哪些資料，這些是我下學期開學後的活動起點。我沒有印講義1養菌方法、講義3觀察與資料搜尋，而是給他們連結，直接請他們自己下載就好，因為很多資料用電子檔比較方便整理。


下學期的應用生物學，第二章有發酵的單元

先講 講義5益生菌與人體，這是從我去紐約自然科學博物館看的展覽＋我們只有10%是人類整理出來的。
然後講講義2發酵原理、講義4呼吸作用與發酵

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二、形成問題+設計實驗                                                                                                                        
然後把學生在寒假養菌的過程中想到的問題用合併列印，印在回收的答案卡後面。
看他們的問題很有趣，大家可以參考看看。沒有受過科學訓練的人，想出來的問題，跟我們的想像很不一樣噢。

接下來讓學生用全班的討論來將問題分類，大概就可以歸納出問題都繞在「原料」「菌種」「產物」「培養條件」這四大因子上（但要從空白的領悟出這四個因子，其實對他們來說有點難度）
然後可以提供便利貼，讓他們去嘗試回答同學的問題。

接下來我找一篇糖水克菲爾的研究報告給學生看。

water kefir的發酵作用(英文)、water kefir的發酵作用(我翻譯的中文)有一些專有名詞我盡力在網路上找，如果不是台灣常用的說法，也非常希望大家跟我說。
這個部分如果可以跟化學老師一起設計教學的引導會很棒！
中文的部分也可以做簡化再給學生，因為內容有很多專有名詞，會讓他們頭很痛。
我想了很久，還是給他們完整版（其實我已經刪掉一些東西了），因為我想讓他們理解真正的研究報告有多嚴謹，所有實驗都是可追蹤、可重複的。所以就忍痛逼他們看完了。

在看完的第一時間，請他們簡單記錄

"摘要"涵蓋內文的哪些內容 []前言 []材料與方法  ⬜[]結果  ⬜[]討論

我注意到材料與方法的書寫重點與特點分別是....

我認為作者在結果與討論所作的區別是......

第一次看正式的研究報告，我發現它與一般的教科書或科學雜誌的不同有..........

這篇報告的內容回答了我的問題.......

我很好奇........

我有想到........

我覺得.........

現在回頭想想，我實在很貪心，光看報告跟討論這個就可以做一個超過四節課的課程，我竟然塞在兩節課裡。雖然有挺不錯的效果，但是其實可以好很多。


要花些時間解釋每一步的實驗設計，因為有一些設計是微生物學專有的。
還有，這個實驗裡的操縱變因只有一個，就是時間。但學生會覺得有很多個！

讓他們共同提問，把看不懂的地方弄懂。


將文章裡的段落分配給不同小組，請小組整理那一段的實驗設計，討論一下這一段到底作者要回答什麼問題～這個對他們超難的喔。
然後請各組簡單講給全班聽。請大家把聽到的結果整理在講義6變因與實驗設計上。

最後把糖水克菲爾發酵的過程與結果跟學生確認一次（講義6water kefir實驗中的結果圖表彙整）

看完，解釋完，讓他們看過後再回頭看前面同學累積問題，用文章中學到的實驗設計與結果再重新回答這些問題。

讓他們小組討論在布幕上選一個喜歡的問題，討論要如何設計實驗來探討。
這對學生很難喔。
首先要讓他們問出一個「可以用實驗檢測的問題」就會花掉一節課
因為
1.要先讓他們將卡片上的疑問，變成一個「問句」
2.這個問句不能是「是否會影響」，而要變成「如何影響」
3.讓問句中的結果是可以量化檢測的

直接用講的讓他們練習會比較簡單，但是我希望能讓他們自己發現「原始的問題」與「受過訓練的問題」的差異，所以就花了超久的時間（也因為我的引導功力低落...）。

問題弄好了，基本實驗設計就好了。
接下來讓他們討論具體的實驗裝置與步驟。
沒做過實驗的學生會對操縱操縱變因的概念很模糊。
例如，如果溫度是變因，他們的原始設計就是「高溫」「低溫」而已。
問他們如何改變溫度，會出現「吹冷氣」、「放冰箱」這種不會出現在老師腦袋中的方法。（據說是因為這兩種機器可以設定溫度）
如果追問溫度要設定幾度，還會出現50度、0度這種想法，超有趣的。
但是如果問他們，如果要讓菌長得比較好的溫度，他們卻又知道是在室溫附近。
對於要如何控制溫度不波動，不知道水浴槽這種東西的學生，會比較無法想像。
總之這個過程超有趣的。

建議先說明操縱變因、控制變因及應變變因的關係，雖然他們學過，但是......you know......

擬定題目	(須為能反映控制變因及測量項目的問句)
操縱變因		說明控制此變因的方法或裝置
控制變因		說明如何設置對照組，並確保控制變因不會影響結果
應變變因		說明測量數據的方法
請以簡圖表示實驗組與設計組的裝置、數量及實驗流程
設計一個紀錄數據的表格		請設計一個圖表呈現數據間的關係

在這個活動的後半，需要學生想像到時候結果要如何記錄，如何做圖。
這有助於他們檢查自己的實驗設計是不是正確。
所以要先從講義6water kefir實驗中的結果圖表彙整來看看正確的作圖。
對我來說，比較難教的是設計一個記錄數據的表格，因為他們從來沒有自己設計實驗過，所以無從想像。

比較正確的做法是他們設計完，跟我確認完設計與器材後，就開始讓各組進行實際操作實驗。
讓他們從操作中發現自己的不精準，從整理數據時發現表格要如何設計才容易記錄，做出圖表後跟大家報告，再來看作圖。

但我教到這邊就懶了，所以只有乾實驗的設計。
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三、執行實驗＋歸納結果＋討論與延伸                                                                                               
這是原先設計想要做而沒做的。